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多肽合成法方介绍

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多肽合成方法介绍

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一:多肽合成中肽键形成的基本原理    

一个肽键的形成(生成一个二肽),从表面上看是一个简单的化学过程,它指两个氨基酸组分通过肽键(酰胺键)连接,同时脱去水。  在温和反应条件下,肽键的形成是通过活化一个氨基酸(A)的羧基部分,第二个氨基酸(B)则亲核进攻活化的羧基部分而形成二肽(A-B)。如果羧基组分(A)的氨基未保护,肽键的形成则不可控制,可能开有成线性肽和环肽等副产物,与目标化合物A-B混在一起。所以,在多肽合成过程中,对不参与肽键形成的所有官能团必须以暂时可逆的方式加以保护。   因此,多肽合成-即每一个肽键的形成,包括三个步聚:  第一步,需要制备部分保护的氨基酸,氨基酸的两性离子结构不再存在;  第二步,为形成肽键的两步反应,N-保护氨基酸的羧基必须先活化为活性中间体,随后形成肽键。这一耦合反应既可作为一步反应进行,也可作为两个连续的反应进行。   第三步,对保护基进行选择性脱除或全脱除。尽管全部脱除要等到肽链全部组装完成后才能进行,但为了继??? 续肽合成,选择性脱除保护基也是必需的。   由于10个氨基酸(Ser、Thr、Tyr、Asp、Glu、Lys、Arg、His、Sec和Cys)含有需要选择性保护的侧链官能团,使肽合成变得更加复杂。因为对选择性的要求不同,所以必须区分临时性和半永久性保护基。临时性保护基用于下一步要反应氨基酸的氨基或羧基官能团的暂时保护,在不干扰已经形成的肽键或氨基酸侧链的半永久性保护基才脱除,有时也在合成过程中脱除。   在理想状态下,羧基组分的活化和随后的肽键形成(耦合反应)应为快速反应,没有消旋或副产物形成,并应用等摩尔反应物以获得高产率。但遗憾的是,还没有一种能满足这些要求的化学耦合方法相比,适用于实际合成的方法很少。   在肽合成过程中,参与多种反应的官能团常常与一个手性中心相连(甘氨酸是唯一的例外),存在发生的消旋的潜在危险。   多肽合成循环的最后一步,保护基要全部脱除。除了在二肽的合成中需要全脱保护以外,选择性脱除保护基对于肽链延长具有非常重要的意义。合成策略要深思熟虑地规划,依战略选择,可以选择性脱除Nα-氨基保护基或羧基保护基。“战略”一词这里是指单个氨基酸的缩合反应顺序。一般来说,在逐步合成和片段缩合之间是有区别的。在溶液中进行肽合成(也指“常规合成”),对困难序列,多数情况下,用肽链逐步延长法只能合成较短的片段。要合成更长的肽时,目标分子必须分割成合适的片段,并确定在片段缩合过程中,它们能使能C端差向异构化程度最小。在单个片段逐步组装完成后,再连接产生目标化合物。肽合成战术包括选择最恰当的保护基组合和最佳的片段偶联方法。   最初的固相多肽合成(SPPS)只是肽和蛋白质逐步合成法的一种变化,其概念是将增长的肽链连接到一个不溶性的聚合物载体上,由Robert Bruce Merrifield在1963年首次报道。今天,为纪念他1984年获得诺贝尔奖而称之为Merrifield。在聚合物载体上,也可以进行片段缩合反应。

二:多肽合成方法之酰基叠氮物法  

早在1902年,Theodor Curtius就将酰基叠氮物法引入到肽化学中,因此它是最古老的缩合方法之一。在碱性水溶液中,除了与酰基叠氨缩合的游离氨基酸和肽以外,氨基酸酯可用于有机溶剂中。与其他许多缩合方法不同的是,它不需要增加辅助碱或另一等当量的氨基组分来捕获腙酸。   长期以来,一直认为叠氮物法是唯一不发生消旋的缩合方法,随着可选择性裂解的氨基酸保护基引入,该方法经历了一次大规模的复兴。该方法的起始原料分别是晶体状的氨基酸酰肼或肽酰肼64,通过肼解相应的酯很容易得到。在-10的盐酸中,用等当量的亚硝酸钠使酰肼发生亚硝化而转化为叠氮化物65,依次洗涤、干燥,然后与相应的氨基组分反应。有些叠氮化物可用冰水稀释而沉淀出来。  二苯磷酰基叠氮化物(DPPA)也可以用于酰基叠氮化物的合成。Honzl-Rudinger方法采用亚硝酸叔丁作为亚硝化试剂,并且使叠氮缩合反应可在有机溶剂中进行。因酰基叠氮化物的热不稳定性,缩合反应需在低温下进行。当温度较高时, Curtius重排,即酰基叠氮转化为异氰酸酯的反应成为一个主要的副反应,最终导致生成副产物脲。由于反应温度低(如4)而导致反应速率相当慢,使得肽缩合反应通常需要几天才能完全。   对于较长的N端保护的肽链,酯基的肼解一般比较困难,因此,使用正交的N保护肼衍生物是一种选择。在肼基的选择性脱除后,按倒接(backing-off)策略组合的肽片段可以用于叠氮缩合。   如前所述,虽然叠氮法一直被认为是消旋化倾向最小的缩合方法,但在反应中,过量的碱会诱发相当大的消旋。因此,在缩合反应期间要避免与碱接触,例如,氨基组分的铵盐应采用N,N-二异丙胺或N-烷基吗啉代替三乙胺来中和。   虽然有上述局限性,但该方法仍很重要,尤其对于片段缩合而言,因为该方法具有较低的异构化倾向,适用于羟基未保护丝氨酸或苏氨酸组分,同时,Nˊ保护的本行酰肼还具有多种用途。

三:多肽合成方法之酸酐法  

在多肽合成中,最初考虑应用酸酐要追溯到1881年TheodorCurtius对苯甲酰基氨基乙酸合成的早期研究。从氨基乙酸银与苯甲酰氯的反应中,除获得苯甲酰氨基乙酸外,还得到了BZ-Glyn-OH(n=2-6)。早期曾认为,当用苯甲酰氯处理时,N-苯甲酰基氨基酸或N-苯甲酰基肽与苯甲酸形成了活性中间体不对称酸酐。  大约在70年后,TheodorWieland利用这些发现将混合酸酐法用于现代多肽合成。目前,除该方法外,对称酸酐以及由氨基酸的羧基和氨基甲酸在分子内形成的N-羧基内酸酐(NCA,Leuchsanhydrides)也用肽缩合。最后应该提到,不对称酸酐常常参与生化反应中的酰化反应。

四:多肽合成方法之混合酸酐法    

有机羧酸和无机酸皆可用于混合酸酐的形成。然而,仅有几个得到了广泛的实际应用,多数情况下,采用氯甲酸烷基酯。过去频繁使用的氯甲酸乙酯,目前主要被氯甲酸异丁酯所替代。   由羧基组分和氯甲酸酯起始形成的混合酸酐,其氨解反应的区域选择性依赖依赖于两个互相竞争的羰基的亲电性和(或)空间位阻。在由N保护的氨基酸羧酸盐(羧基组分)和氯甲酸烷基酯(活化组分,例如源于氯甲酸烷基酯)形成混合酸酐时,亲核试剂胺主要进攻氨基酸组分的羧基,形成预期的肽衍生物,并且释放出游离酸形式的活性成分。当应用氯甲酸烷基酯(R1=异丁基、乙基等)时,游离的单烷基碳酸不稳定,立即分解为二氧化碳和相应的醇。然而,对于亲核进攻的区域选择性,也有一些相反的报道,产物为氨基甲酸酯和原来的N保护氨基酸组分。  为了形成混合酸酐,将N保护的氨基酸或肽分别溶于二氯甲烷、四氢呋喃、二氧六环、乙腈、乙酸乙酯或DMF中,用等当量的三级碱(N-甲基哌啶、N-甲基吗啉、N-乙基吗啉等)处理。然后,在-15--5,剧烈搅拌的同时加入氯甲酸烷基酯以形成不对称酸酐(活化)。经短时间活化后,加入亲核性氨基酸组分。如果作为铵盐使用(需要更多的碱),必须避免碱的过量使用。如果严格按照以上的反应条件,混合酸酐法很容易进行,是最有效的缩合方法之一。   Benoiton和他的同事对混合酸酐的稳定性,减少副产物氨基甲酸酯和消旋等方面进行了深入研究,由此进一步了解了反应机理,并提高了该方法的缩合效率,目前该方法已获得广泛应用。通过研究过量氨基甲酸酯产生的原因,尤其是在异亮氨酰基和缬氨酰基的情况下,发现以二氯甲烷为溶剂和N-甲基哌啶作为三及碱能防止这一主要副反应。混合酸酐对水解有较高稳定性,因此,可以用水洗涤有机相来纯化混合酸酐。从氯甲酸烷基酯制得的混合酸酐的稳定性依赖于使用的烷基。由 Boc-、Z-和 Fmoc-的保护氨基酸和氯甲酸异丙酯制得的混合酸酐能够被分离纯化,比从氯甲酸乙酯或氯甲酸异丁酯获得的混合酸酐更稳定。当没有合适的亲核试剂时,混合酸酐在有机溶剂中的分解起始于环化,生成2-烷氧基-5(4H)-恶唑酮,同时释放出二氧化碳和醇R2-OH,副产物为对称酸酐和酯。   在混合酸酐缩合法的实际应用中,有以下几方面需要注意:虽然含水的DMF对于混合酸酐的形成和随后的缩合反应是一个好的溶剂,但是,正如在Z-Gly-Xaa-OH(Xaa=Ala,Leu,Val,Phe)与H-Val-OEt的反应中所遇到的,它促进消旋的程度比使用四氢呋喃或卤化试剂为溶剂时要高得多。氯甲酸异丙酯优氯甲酸乙酯或异丁酯。有趣的是,在DMF或N-甲基吡咯烷酮中,氯甲酸乙酯活化比氯甲酸异丁酯活化引起的消旋更少。尽管如此,从氯甲酸乙酯制取的混合酸酐,以三乙胺作为三级碱在目前几乎没有实用价值。最初,分别在Nα-甲基磺酰基、Nα-三苯甲基、Nα-三氟乙酰基保护的氨基酸活化中观察到混合酸酐法的副反应。   有时特戊酸(2,2-二甲基丙酸)被推荐作为活化基,用于混合酸酐的合成,对于Nα-酰基保护的天冬酰胺尤其如此。类似地,这种不对称酸酐由Nα-酰基氨基酸和特戊酰氯制得,并且与氨基亲核试剂反应的产率高。特戊酸叔丁基的强+I效

应降低了它的羰基的亲电性,同时还因为空间位阻的影响,使亲核试剂在活化的氨基酸上发生预期的区域选择性进攻。从机理上考虑,这里也要提到酰基磷翁盐作为活性中间体在肽缩合中的应用。

五:多肽合成方法之对称酸酐法    

Nα-酰基氨基酸的对称酸酐是用于肽键形成的高活性中间体。与混合酸酐法相反,它与胺亲核试剂的反应没有模棱两可的区域选择性。但肽缩合产率最高,为50%(以羧基组分计)。   虽然由对称酸酐氨解形成的游离Nα-酰基氨基酸可以和目标肽一起,通过饱和碳酸氢钠溶液萃取回收,但在最初,这种方法的实用价值极低。对称酸酐可以用Nα-保护氨基酸与光气,或方便的碳二亚胺反应制得。两当量的Nα-保护氨基酸与-当量的碳二亚胺反应有利于对称酸酐的形成,对称酸酐可以分离出来,也可不经纯化而直接用于后面的缩合反应。基于Nα-烷氧羰基氨基酸的对称酸酐对水解稳定,可采用类似上述纯化混合酸酐的方法进行纯化。   由于Boc-保护氨基酸的商品化和合理的价格,在肽链的逐步延长中,使用对称酸酐法日益受到重视。虽然可以买到晶状的对称酸酐,但原位制备仍然是一种不错的选择。

六:肽合成方法-N-羧基内酸酐法    

Hermann Leuchs在1906看发现,在N-羧基内酸酐(NCA)中,氨基酸的羧基活化和酰基保护同时发生。因此,在德国文献中,又称之为Leuchs-酸酐。原则上,该类衍生物应具备理想的前提条件以应用于多肽合成。   第一个N-羧基内酸酐(1,3-氧氮杂环戊烷-2,5-二酮)是从N-(乙氧羰基)氨基酸酰氯消除氯乙烷而得到的。制备该类衍生物的一个好方法是游离氨基酸与光气反应,相应的氨基甲酰氨为中间体。然而,痕量的水就能使N-羧基内酸酐发生聚合,因为最初形成的氨基甲酸自动脱去羧基得到游离胺,此游离胺是发生进一步开环反应的亲核试剂。因此,NCA方法在肽合成中的应用一直受到限制,直到1966年才探索出正确的反应条件,可以在水性介质中用N-羧基内酸进行有条件的肽合成。在低温和pH值为10.2的条件下,N-羧基内酸酐能迅速酰化氨基酸和肽。在pH值增加到10.2时,同时加入下一种N-羧基内酸酐,开始下一轮缩合。为减少中间体肽氨基甲酸酯和氨基组分间的羧酸酯的交换,必须剧烈搅拌反应混合物。精确控制pH值是另一个前提条件(氨基酸要求在pH值为10.2-10.5,肽要求在pH值为10.2),因为当pH值大于10.5时,产生副产物乙内酰脲。N-羧基内酸酐的硫类似物即N-硫代羧基内酸酐(N-thiocarboxy  anhydrides,NTA)也可以用于肽合成,因为硫代氨基甲酸酯具有较高的稳定性。酰化反应可以在pH值低到9-9.5时进行,因而可以防止可能的水解转化为乙内酰脲。NCA/NTA方法尤其适用于不需要分离反应中间体的片段缩合。三官能团氨基酸(除赖氨酸和半胱氨酸)不需要侧链保护。采用该方法已组合了核糖核酸酶S-蛋白的几个片段,之后采用叠氮物法可得到完整的S-蛋白。最近,NCA方法再一次引起极大的关注,归功于已制备出氨基甲酸酯保护的N-羧基内酸酐(urethane-protected N-carboxyanhydrides,UNCA),并用于肽合成。在非质子溶剂中和三级碱存在的条件下,利用合适的试剂,可以将NCA的环上氮原子酰化,引入Boc、 Z或 Fmoc基团,得到相应的UNCA68(Y=Boc,Z, Fmoc)。从大多数氨基酸可获得UNCA晶体,并在无水条件下稳定存在。UNCA对亲核试剂表现出高反应活性,在常用于肽固相和液相合成的大多数无水溶剂(除醇以外)中,高速形成所需肽键。二氧化碳是唯一的副产物,并且没有发生寡聚或聚合的危险,因为在缩合反应后,增长中的肽链氨基端仍然被氨基甲酸乙酯保护着。最近又报道了N-三苯甲基和N-苯基勿甲基保护的NCA。

七:多肽合成方法之碳二亚胺法    

碳二亚胺类化合物可用于氨基和羧基的缩合。在该类化合物中N,Nˊ-二环己基碳二亚胺(DCC)相对便宜,而且可溶于肽合成常用的溶剂。在肽键形成期间,碳二亚胺转变为相应的脲衍生物,N,Nˊ-二环己基脲可以从反应液中沉淀出来。显然,碳二亚胺活化后的活性中间体氨解和水解速率不同,使肽合成能在含水介质进行。经几个课题组的大量研究,确立了以碳二亚胺为缩合剂的肽缩合反应机理,羧酸根离子加成到质子化的碳二亚胺,形成高活性的O-酰基脲;虽然还没有分离出这个中间体,但通过非常类似的稳定化合物推断了它的存在。O-酰基脲与氨基组分反应,产生被保护的肽和脲衍生物。或者,与质子化形式处于处于平衡状态的O-酰基异脲,被第二个羧酸酯亲核进攻,产生对称的氨基酸酐和N,Nˊ-二取代脲。前者与氨基酸反应得到肽衍生物和游离氨基酸。在碱催化下,使用DCC的副反应使酰基从异脲氧原子向氮原子转移,产生N-酰基脲71,它不再发生进一步的氨解。不仅过量的碱可催化O-N的酰基转移,而且碱性的氨基组分或碳二亚胺也可催化该副反应。  另外,极性溶剂有利于这一反应途径。

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