Polypeptide Basics

多肽相关基本知识

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1..多肽合成的基本原理?

多肽固相合成法是多肽合成化学的一个重大的突破。它的最大特点是不必纯化中间产物，合成过程可以连续进行，进而为多肽合成的自动化奠定了基础。目前全自动多肽的合成，基本都是固相合成。其基本过程如下：

基于Fmoc化学合成，先将所要合成的目标多肽的C-端氨基酸的羧基以共价键形式与一个不溶性的高分子树脂相连，然后以这一氨基酸的氨基作为多肽合成的起点，同其它的氨基酸已经活化的羧基作用形成肽键，不断重复这一过程，即可得到多肽。根据多肽的氨基酸组成不同，多肽后处理方式不同，纯化方式也有差异。

2.做免疫用的多肽多长为合适?

答：一般约10-15个氨基酸，当然长一些免疫效果好一些，不过合成费用也会增加。MAP多肽则希望长度在15aa以上，效果较好。另外，10aa以下的多肽免疫效果比较差。

3.免疫用多肽的纯度需要很高吗?

答：一般而言，免疫用Peptide，70-85%即可。

4.我们合成的多肽溶解性不好，多肽就有问题对吗?

答：很难准确预测一个多肽的溶解性及合适的溶剂是什么。如果多肽难以溶解就认为多肽合成有问题这个观念并不正确。

5.多肽状态是如何?如何保存储存?

答：我们提供的多肽是粉末状，一般为灰白色，组成不同，多肽粉末的颜色有差异，多肽一般长期保存需要避光保存，并应保存在-20度，短期可以保存在4度。可以短时间的话是以室温运输。

6.如何溶解多肽?

答：溶解多肽是非常复杂的事情，一般很难一下子确定合适的溶剂。通常是先取一点试验，在没有确定合适的溶剂前千万不要合部溶解。 下列方法有助于您选择合适的溶剂：

(1)判定多肽的电荷特定，设定酸性氨基酸Asp(D),Glu(E)和C端COOH为-1；碱性氨基酸Lys(K),Arg(R),His(H)及N端NH2为+1,其它氨基酸的电荷为0。计算出将电荷数。

(2)如果净电荷数>0，多肽为碱性，用水溶解：如果不溶解或溶解性不大，加入醋酸(10%以上)；如果多肽还不能溶解，加入少量TFA(25ul)溶解，然后加入500ul水稀释。

(3)如果净电荷数<0，多肽为酸性，用水溶解；如果不溶解或溶解性不大，加入氨水(25ul)溶解，然后加入500ul水稀释。

(4)如果净电荷数=0，多肽为中性，一般需要用有机溶剂如乙腈，甲醇或异丙醇，DMSO等溶解。还有人建议需要尿素来溶解疏水性很大的多肽。

7.非HPLC纯化的多肽中有哪些杂质?

答：粗品和脱盐级别的多肽中多肽和非多肽类杂质：如非全长多肽和多肽后处理的一些原料如DTT、TFA等。

8.HPLC纯化的多肽有哪些杂质?

答：经过HPLC纯化的多肽，仍会有一些一些杂质存在，其中的杂质主要是短肽和微量TFA。

9.多长的多肽为合适?

答：多肽合成需要考虑多肽的长度，电荷，亲疏水性等因素。长度越长，合成粗品的纯度和产率都随着降低，纯化的难度和无法合成的几率就会大些。当然多肽功能区的序列是无法改变的，但是为了多肽的顺利合成，有时不得不在功能取的上下游增加一些辅助氨基酸，以改善多肽的溶解性和亲疏水性。如果多肽太短，合成也可能有问题，主要问题是合成的多肽在后处理过程中有一定的难度，5肽以下的多肽，一般要有疏水的氨基酸，否则后处理难度加大。15个氨基酸残基以下的多肽一般都可以得到满意的产率和得率。

10.如何从多肽序列中判定多肽的溶解性?

(1)多肽中如果含有高比例的疏水性很强的氨基酸如和Leu,Val,IIe,Met,Phe和Trp，多肽很难溶解与水性溶液中或根本不可能溶解。这些氨基酸无论是纯化或合成，都有可能有问题。

(2)一般情况下疏水性氨基酸的比例<50%，不能连续5个连续aa为疏水性，带电荷的氨基酸的(正电荷K,R,H,N-terminus,负电荷D,E,C- terminus)的比例达到20%，在多肽的N或C短如果能增加极性氨基酸，也可以改善溶解性。

11.为什么含有Cys,Met,或Trp的多肽难合成?

答：含有Cys,Met，或Trp的多肽难以合成，同时难以获得高纯度的产品。主要因为这些基团不稳定，易氧化。这些多肽的使用和储存都需要特别注意，避免反复开启盖子。

12.为什么有些多肽的合成产率或纯度会比较低?

答：多肽合成与引子合成有比较大的区别，不能合成的引子很少，但是不能合成的多肽经常有。如Val,Ile,Tyr,Phe,Trp,Leu,Gln,和Thr这些氨基酸比邻或重复时，多肽链在合成过程中不能完全舒展溶解，合成效率下降。以下几种情形，合成效率和产物的纯度都比较低，如：重复Pro,Ser-Ser，重复Asp，4个连续Gly等。

13.多肽是如何纯化的?

答：多肽纯化一般使用反相柱(如C8，C18等)，214nm。缓冲体系通常为含TFA的溶剂，pH2.0。Buffer A为含0.1%TFA in ddH2O，Buffer B为1%TFA/ACN/pH2.0。纯化前用Buffer A溶解；如果溶解不好，用Buffer B溶解后，然后用Buffer A稀释；对疏水性强的多肽，有时还需要加入少量的Formic Acid或醋酸。HPLC分析多肽粗产物，如果多肽不长(15aa以下)，一般会有主峰，主峰通常为全长产物；对于20aa以上的长肽，如果没有主峰，HPLC需搭配Mass来判定分子量，进而确定哪个峰是所要合成的多肽。

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